，邀请高校、科研院所公共技术平台的老师分享技术心得和经验，方便生命科学领域研究人员了解有关技术进展，学习仪器使用方法。本篇为深圳湾实验室生物影像平台助理工程师黄诗娴供稿。本文详述了转盘共聚焦显微镜的技术原理和优势、历史沿革、功能和主要应用。

  1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。随着激光器技术等各类技术的加快速度进行发展，共聚焦显微成像技术更成熟完备，开始大范围的应用于生命科学、材料科学等每个方面。传统的激光点扫描共聚焦显微镜使用逐点扫描，虽然隔绝了非焦平面的杂散光信号，提高了成像分辨率及信噪比，但是成像速度较慢。其光电倍增管检测器PMT的光电转换效率也比较低，需要较强的激发光。未解决快速变化过程的共聚焦检测问题，实现活细胞长时间成像，发展了转盘共聚焦显微镜（Spinning-disk Confocal Microscopy，SDCM），解决了传统激光点扫描共聚焦显微镜成像速度相对较慢以及光毒性较高的问题。

  转盘共聚焦显微镜的概念最早是在1968年由Petrán提出的，在20世纪90年代由日本Yokogawa Electric公司发明了其核心技术：双转盘专利技术。双转盘装置包含了两个同轴排列的转盘，上转盘是带有微透镜阵列的转盘，下转盘是放置在物镜像平面上的带有约20000个阿基米德螺旋状针孔的Nipkow转盘，针孔及微透镜的位置是一一对应的，两个转盘的间距为微透镜的焦距。显微镜工作时，入射光经过微透镜阵列聚焦到Nipkow转盘针孔上，经针孔隔除杂散光后照射在样本上，无需移动载物台或使用扫描振镜，双转盘可进行多点同步扫描，旋转双转盘就可以实现对样本的完整扫描，大幅度的提升了采集速度。使用微透镜阵列聚焦激发光，照明光的透射率从使用单Nipkow转盘的4%-6%增加到40%-60%，逐步降低激发光的强度，即使是荧光蛋白表达量非常低的活细胞也能轻松成像。

  Yokogawa Electric公司设计了转盘式显微镜目前最先进的共聚焦扫描单元（Confocal Scanner Unit ，CSU）（图1），其CSU-X1转盘最高旋转速度为每分钟10000转，理论上最大帧率高达每秒2000帧。较慢的CSU-W1转盘转速也有4000转，成像速度最大可达200帧/秒，非常适用于快速变化过程检测。

  转盘共聚焦显微镜的主要优势之一是使用面阵相机进行成像。激光点扫描共聚焦系统的PMT检测器的量子效率较低，通常为30%-40%，而SDCM使用EMCCD或背照式sCMOS等相机作为探测器，可具有更高的量子效率，以此来降低激发光功率，大幅度的降低了对样品的光漂白和光损伤。为了让相机尽可能多地收集光子，获取高质量图像，应选择高灵敏度的相机。EMCCD相机低噪声、高灵敏，曾经是转盘共聚焦显微系统的第一选择。而如今背照式sCMOS的量子效率可高达95%，且具有与EMCCD相当的灵敏度，其被使用率开始逐渐高于EMCCD相机。此外，背照式sCMOS具有低噪声、高帧率、高动态范围、高分辨率、大靶面的特点，而且功耗更低、集成度更高，成本更低。因此，在未来的发展中，背照式sCMOS有望成为更加主流的图像传感器，应用于各类显微成像技术中。总而言之，转盘共聚焦显微镜因为双转盘技术和高量子效率相机的组合，可以高速运行并且有很高的信噪比。

  转盘共聚焦显微镜因其成像速度快，层切能力好等特点，常用于多通道荧光成像、拼图及三维成像，如多荧光通道全脑片成像，斑马鱼、透明化小鼠等大组织厚样本三维拼图成像等。转盘共聚焦显微镜可以配置单相机或多相机，配置多个激光器及对应的滤光片组，快速成像多个荧光标记的样本。通过移动电动载物台实现多视野拼图成像，为防止拼痕，需做好仪器放大倍数校正、阴影校正及光照均匀度校正等，同时配置合适的拼图软件模块，得到所需大图。通过上下移动物镜或者压电陶瓷载物台实现Z stack三维扫描，结合三维重构软件模块，得到所需三维图像或最大投影图等。

  因转盘共聚焦显微镜成像采集速度快及光毒性低等优点，很适合于活细胞成像及活细胞长时程成像，检测信号快速变化过程及信号长时间变化过程，满足细胞动力学、发育生物学等多方面的研究需求。活细胞成像需在显微镜上配置细胞培养装置，提供适宜的培养环境。配置使激光器照明和相机成像达成微秒级别同步的实时控制器，以降低光漂白和光毒性，使细胞在复杂的试验中保持健康的状态。仪器在进行XYT、XYZT成像，甚至是结合多视野、拼图、超分辨的时间序列成像时，需要配置超稳定的锁焦系统使样本始终处于聚焦状态，如Olympus的Z轴漂移补偿系统IX3-ZDC2，Nikon的完美聚焦系统PFS等。进行多视野的时间序列成像时，需要配置高精度的电动载物台，或确保载物台位移精度在可接受范围内。当载物台位移精度较低时，移动到每个成像视野会有较明显的位置偏差，导致成像结果视频中观察的样本出现肉眼可见的抖动现象，高倍镜成像时会越来越明显，影响数据查看及成像分析。同时结合相应的分析软件，获得所需活细胞及时间序列的成像分析结果。

  高内涵细胞成像与分析系统大多使用转盘共聚焦显微成像技术。高内涵细胞成像与分析系统需同时具备自动化高速显微成像功能及自动化图像定量分析功能，可对多个样品快速成像，并从图片中提取大量的数据信息。转盘共聚焦显微成像技术既能够迅速地获取多孔板大量的图像数据，并且相较于宽场荧光显微镜而言具有更高的图像分辨率及信噪比，能够给大家提供全自动、高速和高分辨率成像筛选的多种解决方案，能满足药物发现和高通量生物学中多种需求。此外，使用转盘共聚焦显微成像技术还能进行z轴扫描获取三维图像，例如对类器官、组织或3D肿瘤球等三维样本成像，从而进一步分析更多的生理学有关问题。转盘共聚焦显微镜上能添加各类功能扩展模块，例如超分辨成像模块和光刺激模块等。可以在转盘共聚焦显微镜上添加超分辨成像模块，如Olympus的超分辨技术OSR，是对共聚焦荧光显微镜截止频率附近逐渐减弱的高频信号，进行空间放大的空间频率滤波器，称为OSR滤波器。SpinSR10的SoRa转盘中，在50um针孔盘下添加了微透镜阵列，进一步缩小光斑，提升3~6倍的照明亮度。其可对细胞内深达100微米的区域进行成像，使用常规荧光染料即可在120 nm的分辨率下，采集到各种活细胞样品亚细胞结构的超分辨率图像。还可以在转盘共聚焦显微镜上添加光刺激或光操作实验模块，可进行荧光漂白后恢复FRAP、荧光漂白后缺失FLIP、荧光漂白后定位FLAP、光活化与光转换PA&PC等实验。

  下一篇作者将根据深圳湾实验室生物影像平台管理经验介绍生物影像平台设备管理心得及未来可提升空间，敬请期待！

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